Aksolotta omurilik hasarı sonrası rejenerasyonu sağlayan moleküler mekanizmaların proteomiks yöntemleri ile tanımlanması

Abstract

Aksolot (Ambystoma mexicanum), amfibi sınıfı, semender grubuna mensup bir rejenerasyon kapasitesi son derece yüksek olan bir omurgalı canlı türüdür. Yenilenme ve doku tamir mekanizması hala tam olarak anlaşılmamakla birlikte, bir hasar durumunda uzuvlarını (ön ve arka ayaklarını), kuyruğunu, iç organlarını ve merkezi sinir sistemi organları olan beyin ile omuriliği yenileme yeteneğine sahiptir. Aksolotta ampute edilmiş bir organın tekrar oluşumunun başarılı olması rejenerasyona spesifik bir doku olan blastema dokusunun oluşmasıyla ilişkilidir. Aksolotların çok sayıda fonksiyonel ve yapısal protein ile sinyal yolağının memelilerle aynı olması aksolotlarla yapılan deneylerden elde edilecek bilgilerin memelilerde uygulanma potansiyelini artırmaktadır. Bu tez kapsamında omurilik hasarının sürecinde önemli roller oynayan mekanizmaların bulunabilmesi için neotenik ve metamorfik aksolotta omurilik hasarı sonrası farklı zaman aralıklarında (0.saat, 6.saat, 12.saat, 24.saat, 4.gün ve 7.gün) hasar bölgesinden blastema örnekleri alınmış, bu örneklerin proteomiks çalışmaları yapılarak, omurilik rejenerasyonunda rol oynayan proteinlerin tanımlanması amaçlanmıştır. Cerrahi operasyonlar sonrasında hem neotenik hem de metamorfik aksolotların omuriliklerini rejenere edebildiği görülmüştür. Metamorfik aksolotlarda cerrahi operasyon sonrası abdomen bölgesinde sıvı birikimi gözlemlenmesinin, metamorfozu ile beraber değiştiği düşünülen immün sistem ile ilişkili olabileceği öne sürülmüştür. Buna ek olarak yapılan proteom dizi analizlerinde TRIzol protein izolasyonunu takiben izlenen FASP örnek hazırlama protokolü arasındaki uyumsuzluk olduğu görülmüştür. TRIzol protein izolasyonunu takiben FASP protokolüne geçilmesi tanımlanabilecek protein sayısını düşürdüğü, FASP protkolü hem protein izolasyonu ve hem de örnek hazırlığı için tercih edildiğinde ise tanımlanan protein sayısının arttığı görülmüştür.

Among highly regenerative vertebrates amphibian axolotl (Ambystoma mexicanum), even though it's regeneration and tissue repair mechanism is still not completely understood. Upon injury axolotls can regenerate it's limb, tail, internal organs and central nervous system organs such as brain and spinal cord. Successful regeneration of the amputated organ is associated with the formation of blastema tissue, a tissue specific to regeneration. Since the axolotls share large number of functional and structural proteins and signaling pathways with mammals, it is possible to use the information we learn from studying this organism on mammals. In this thesis, in order to find the mechanisms that play important roles in the process of spinal cord regeneration, blastema tissue samples are collected at different time points (Hour 0, Hour 6, Hour 12, Hour 24, Day 4 and Day 7) from neotenic and metamorphic axolotl following spinal cord injury. Following the sample collection proteomics analysis of the samples were conducted. The aim of the proteomics analysis was to identify proteins that play a role in spinal cord regeneration. It has been shown that both neotenic and metamorphic axolotls were able to regenerate their spinal cord after spinal cord injury. The observation of fluid accumulation in the abdomen region of metamorphic axolotls after surgical operations may be related to the changes in the immune system due to metamorphosis. In addition, it was found that there was a discrepancy between the TRIzol protein isolation protocol and the FASP sample preparation protocol. Following the TRIzol protein isolation, it was observed that the transition to the FASP protocol decreased the number of proteins that could be identified, and the number of proteins defined could be increased when FASP was preferred for both protein isolation and sample preparation.