Mikro elektrot düzeneği ve optogenetik araçlar kullanılarak hipokampal nöronlarda bellek oluşumunun incelenmesi

Abstract

Sinirsel ağların sergilediği özelliklerin elektrofizyolojik olarak incelenmesi, öğrenme, bellek oluşumu ve sinirsel kodlama gibi konuları araştırmak için esnek ve verimli bir platform sağlar. Öğrenme ve bellek oluşumunun temelinde uzun süren potansiyel artış ve azalışının etkisi olduğu düşünülmekte ve çoğunlukla bu çerçeve altında araştırılmaktır. Bu çerçeve, başta hipokampüs olmak üzere bağlantı yolları bilinen doku kesitleri kullanılarak gerçekleştirilmiş pek çok çalışmada incelenmiştir. Ancak, ayrıştırılmış kültürlerde gelişen sinirsel ağlarda in vivo organizasyon bulunmadığından, uzun süren potansiyel artış ve azalışı üzerinden ortaya konmuş olan yöntem ve tanımlamalar yeterli değildir. Bu çalışmada, ayrıştırılmış kültürlerde gelişen sinirsel ağlarda, dışarıdan verilen uyarıların kodlanması ve öğrenilmesinin araştırılması için yeni bir yaklaşım kullanılmıştır. Kullanılan yaklaşım çerçevesinde, ayrıştırılmış kültürlerdeki sinirsel ağlarda uzun süren potansiyel artışın uygulanabilmesi için yeni bir protokol geliştirilmiştir. Bunun için mikro elektrot dizileri üzerine ekilen hipokampal sinir ağları kullanılmış ve kalsiyum görüntülemesi yönteminden yararlanılmıştır. Kalsiyum görüntülemesi yöntemi için optogenetik araç olarak genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörü kullanılmıştır. Yüksek zamansal çözünürlükteki elektriksel etkinlik verileri modellenerek kalsiyum geçiş verileri ile karşılaştırılabilir hale getirilmiştir. Korelasyon analizi kullanılarak iki yöntemden elde edilen sonuçların benzerlikleri ortaya konmuştur. Geliştirilen protokol, kontrol deneyleri ve uzun süren potansiyel artışta etkili olduğu düşünülen reseptörlerin bloklanması ile yinelenen deneyler ile doğrulanmıştır. Bu protokol ile elde edilen sonuçlar, uzun süren potansiyel artışın erken ve geç evrelerinin oluşturulabildiğini göstermiştir. Ardından düzenleyici girdi olarak dopaminin uzun süren potansiyel artışın oluşumundaki etkisinin incelendiği deneyler gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmanın sonucunda, ayrıştırılmış sinir ağları üzerinde kullanılabilecek etkin bir yöntem elde edilmiştir.

Electrophysiological studies on the properties of neuronal networks provide a flexible and efficient platform to investigate issues such as learning, memory formation and neuronal encoding. Since long-term potentiation and depression are thought as the bases of learning and memory formation, most studies are carried out under this framework. This framework has been investigated in many studies that use slices obtained from tissues with known connection pathways, especially from the hippocampus. However, since neuronal networks that develop in dissociated cultures lack the in vivo organization, the methods and definitions that have been demonstrated on long-term potentiation and depression are not sufficient. In this study, a new approach was employed to investigate encoding and learning of external stimuli in neuronal networks grown in dissociated cultures. Using the new approach, a protocol has been developed to apply the long-term potentiation and depression in neuronal networks in dissociated cultures. In this approach, hippocampal neuronal networks were cultured on micro electrode arrays and calcium imaging was utilized for monitoring neuronal activity. For the calcium imaging, a genetically encoded calcium indicator was used as an optogenetic tool for indicating calcium transitions. The electrical activity data with high temporal resolution are modeled and has been made comparable with calcium transition data. By using correlation analysis, the similarities of the results obtained from these two methods were revealed. The developed protocol has been validated by both control experiments and experiments repeated with blocking of receptors thought to be effective in long-term potentiation. The results obtained with this protocol showed that early and late stages of long-term potentiation can be produced. Then, experiments were carried out to examine the effect of dopamine on the formation of long-term potentiation as a regulatory input. As a result of this study, an efficient method that can be used on dissociated neuronal networks has been obtained.