Lentiviral MYDGF üretimi, çoğaltılması ve iletimi

Abstract

Gen tedavisi, hastalığa sahip hücrelerde genetik bozuklukların düzeltilmesi amacıyla ilgili genlerin aktarımı olarak tanımlanan bir tedavi yöntemidir. Terapötik gen olarak adlandırılan tedavi edici bu genlerin aktarım amacı, mutasyon sonucu oluşan fonksiyon kayıplarını geri getirmek veya eksik olan gen ürününün ekspresyon seviyesini fizyolojik olarak normal seviyelere getirmektir. Ekpresyon artırma, bastırma veya gen onarma gibi ihtiyaçlara göre üretilen terapötik gen vektör adı verilen genetik materyali çeşitli hücrelere, dokulara ve tüm organlara taşıyan araçlar olan vektörler aracılığla yüklenmektedir. Gen tedavisinde taşıyıcı olarak rol alan vektörler viral ve viral olmayan vektörler olarak iki sınıfa ayrılır. Viral vektörler, viral olmayan vektörlere göre daha etkin bir gen tedavi fırsatı sunmaktadır. Lentiviral vektörler, güçlü transdüksiyon özelliklerine ve kararlı ifade yeteneklerine sahip olduklarından dolayı gen tedavisinde etkin yöntemlerden biri olarak kabul edilirler. En önemli özelliklerden biri ise sadece bölünen değil, bölünmeyen hücreleri de enfekte edebilme yetenekleridir. Miyeloid türevli büyüme faktörü (MYDGF) kemik iliği kaynaklı monositlerden/makrofajlardan salgılanan parakrin etkili bir proteindir. MYDGF, MAPK1 / 3-, STAT3- ve CCND1 aracılı sinyal yolakları üzerinden endotel hücre çoğalmasını düzenler. PI3K / AKT'ye bağımlı sinyal yolağında ise kardiyak miyosit ölümünü inhibe eder. Bu tezde, miyokardiyal enfarktüs, romatoid artrit, hepatosellüler kanser gibi çeşitli hastalıklara tedavi seçeneği sunmak adına MYDGF'yi lentiviral vektör olarak üretmek, çoğaltmak ve hücreye aktarımını sağlamak amaçlanmıştır. Bu tez çalışmasında kullanılan MYDGF geni, SH-SY5Y hücre hattından elde edilmiştir. MYDGF, pLenti-CMV-GFP-2A-Puro vektörüne klonlanıp uygun paketleme plasmidleri yardımıyla HEK293T hücrelerine verilerek lentiviral vektörü üretilmiş, çoğaltılmış ve hedef hücreye aktarımı sağlanmıştır. Bu çalışmadaki lentiviral vektör yardımı ile MYDGF geninin hücreye aktarılma yöntemi gelecekte yapılacak olan MYDGF geni ile ilgili hastalıların gen tedavisi çalışmalarına yardımcı olacaktır.

Gene therapy is a treatment that is defined as the transmission of genes of interest in order to correct genetic disorders in the cells with disease. The therapeutic purpose of these genes called therapeutic genes, is to restore functional loss resulting from mutation or to bring back the level of expression of the missing gene product to physiologically normal levels. The therapeutic gene produced according to needs such as expression enhancement, suppression, or gene repair is carried by vectors, which act like a vehicle to the genetic material transportation, into a variety of cells, tissues and all organs. These carrier vectors in gene therapy are divided into two classes as viral and non-viral vectors. Viral vectors offer a more efficient gene therapy compared to non-viral vectors. Lentiviral vectors are considered to be effective methods in gene therapy because of their strong transduction properties and stable expression abilities. One of the most important features is the ability not only to divide but also to infect non-dividing cells. Myeloid-derived growth factor (MYDGF) is a paracrine-effective protein secreted from bone marrow-derived monocytes / macrophages. MYDGF regulates endothelial cell proliferation through MAPK1 / 3-, STAT3- and CCND1 mediated signaling pathways. In the PI3K / ACT-dependent signaling pathway, it inhibits cardiac myocyte death. The aim of this thesis is to produce, reproduce and transfer the MYDGF as a lentiviral vector to provide treatment alternatives for various diseases such as myocardial infarction, rheumatoid arthritis, and hepatocellular cancer. The MYDGF gene used in this thesis was obtained from SH-SY5Y cell line. The MYDGF was cloned into the pLenti-CMV-GFP-2A-Puro vector and delivered to HEK293T cells with the help of appropriate packaging plasmids, produced as lentiviral vector, amplified and transfered to the target cell. Thanks to this study, in future, the method of transferring the MYDGF gene to the cell with the help of the lentiviral vector will help the gene therapy for the patients with MYDGF generelated disease.