HPLC floresan dedektör kullanılarak poliaminlerin serumda saptanması için metot geliştirme ve validasyonlarının yapılması

Abstract

Poliaminlerin canlı organizmalarda büyüme faktörü olarak ve metabolik olayları düzenlemede önemli görevleri vardır. Doğal poliaminler; putresin, spermidin ve spermin tüm canlı hücrelerde bulunur. Poliaminlerin ölçümü, kanserde prognoz takibi dâhil pek çok metabolik durumun takibinde önemlidir ancak poliamin ölçümünde metot standardizasyonu ve validasyon eksikliği yeni araştırmalar için önemli bir engeldir. Bu çalışmada poliaminler, Food and Drug Administration (FDA)'in Endüstri İçin Biyoanalitik Yöntem Validasyonu ve European Medicines Agency (EMA)'nın Biyoanalitik Yöntem Validasyonu kılavuzlarına göre valide edildi. 100 µl serum örnekleri 1.5 M HCIO4 ile ön muameleye tutuldu ve 2 M K2CO3 ile protein yapıları çöktürüldü. Poliaminlerin o-Fitalaldehit ve N-Asetil-L-sistein ile in-line türevlendirme yöntemiyle ters faz C18 HPLC kolonunda 30 dk.'lık gradient program ile ayrım sağlanarak 340 nm'lik eksitasyon ve 450 nm'lik emisyon dalga boyunda floresan dedektörde tespit edildi. Putresin, spermidin ve spermin için alt doğrusallık limitleri sırasıyla 0.1-250 ng/ml, 0.5-250 ng/ml ve 1-250 ng/ml; en düşük miktar tayini alt sınırları 0.2 ng/ml, 0.5 ng/ml ve 1.0 ng/ml ; geri kazanım değeri %89.6, %89.6 ve %88.4 olarak bulundu. Putresin, spermidin ve spermin için sırasıyla gün içi doğruluk değerleri %6.3-13.6, %3.4-8.6 ve %1.5-6.0; kesinlik değerleri %0.9-1.7, %0.2-0.3 ve %0.1-0.7 bulundu. Putresin, spermidin ve spermin için sırasıyla günler arası doğruluk değerleri %5.7-12.4, %6.1-9.1 ve %4.5-12.6; kesinlik değerleri %6.2-9.7,%1.6-6.1 ve %5.4-13.8 bulundu. Bu çalışmada, mevcut yöntemlerde numune hazırlama basamağındaki santrifüj süresi 15 dk.dan 3 dk.ya düşürüldü ve böylece geri kazanım % 60'lardan %90 lara doğru arttırıldı. İlk defa Waters Nova-Pak C18 3.9 mm, 150 mm ve 4 µm özelliklerinde kromatografi kolonu kullanıldı. Mevcut metotta kullanılan metanol yerine asetonitril kullanıldı. Geliştirilen yeni gradient programı ile pik saflığı ve yeterli pik ayrımı sağlandı. Sonuç olarak bu çalışmada poliaminler için HPLC yöntemi ile hassas, duyarlı, güvenilir, tekrarlanabilir bir metot geliştirilmiş ve validasyonu yapılmıştır.

Poliaminlerin canlı organizmalarda büyüme faktörü olarak ve metabolik olayları düzenlemede önemli görevleri vardır. Doğal poliaminler; putresin, spermidin ve spermin tüm canlı hücrelerde bulunur. Poliaminlerin ölçümü, kanserde prognoz takibi dâhil pek çok metabolik durumun takibinde önemlidir ancak poliamin ölçümünde metot standardizasyonu ve validasyon eksikliği yeni araştırmalar için önemli bir engeldir. Bu çalışmada poliaminler, Food and Drug Administration (FDA)'in Endüstri İçin Biyoanalitik Yöntem Validasyonu ve European Medicines Agency (EMA)'nın Biyoanalitik Yöntem Validasyonu kılavuzlarına göre valide edildi. 100 µl serum örnekleri 1.5 M HCIO4 ile ön muameleye tutuldu ve 2 M K2CO3 ile protein yapıları çöktürüldü. Poliaminlerin o-Fitalaldehit ve N-Asetil-L-sistein ile in-line türevlendirme yöntemiyle ters faz C18 HPLC kolonunda 30 dk.'lık gradient program ile ayrım sağlanarak 340 nm'lik eksitasyon ve 450 nm'lik emisyon dalga boyunda floresan dedektörde tespit edildi. Putresin, spermidin ve spermin için alt doğrusallık limitleri sırasıyla 0.1-250 ng/ml, 0.5-250 ng/ml ve 1-250 ng/ml; en düşük miktar tayini alt sınırları 0.2 ng/ml, 0.5 ng/ml ve 1.0 ng/ml ; geri kazanım değeri %89.6, %89.6 ve %88.4 olarak bulundu. Putresin, spermidin ve spermin için sırasıyla gün içi doğruluk değerleri %6.3-13.6, %3.4-8.6 ve %1.5-6.0; kesinlik değerleri %0.9-1.7, %0.2-0.3 ve %0.1-0.7 bulundu. Putresin, spermidin ve spermin için sırasıyla günler arası doğruluk değerleri %5.7-12.4, %6.1-9.1 ve %4.5-12.6; kesinlik değerleri %6.2-9.7,%1.6-6.1 ve %5.4-13.8 bulundu. Bu çalışmada, mevcut yöntemlerde numune hazırlama basamağındaki santrifüj süresi 15 dk.dan 3 dk.ya düşürüldü ve böylece geri kazanım % 60'lardan %90 lara doğru arttırıldı. İlk defa Waters Nova-Pak C18 3.9 mm, 150 mm ve 4 µm özelliklerinde kromatografi kolonu kullanıldı. Mevcut metotta kullanılan metanol yerine asetonitril kullanıldı. Geliştirilen yeni gradient programı ile pik saflığı ve yeterli pik ayrımı sağlandı. Sonuç olarak bu çalışmada poliaminler için HPLC yöntemi ile hassas, duyarlı, güvenilir, tekrarlanabilir bir metot geliştirilmiş ve validasyonu yapılmıştır.