Lentiviral mertk üretimi, çoğaltılması ve iletimi

Abstract

Gen tedavisi; hastalığın gelişmesinden sorumlu olan kalıtsal ya da sonradan kazanılan genetik bozuklukların düzeltilmesi amacıyla hücrelere faydalı genler ve kısa oligonükleotid dizilerinin aktarımı olarak tanımlanır. Gen tedavisinde sağlıklı hücrelere genleri vermek ve gen hasarlarını onarmak için gen ilavesi, gen değişimi, gen ifadesinin baskılanması, insersiyon ve özel hücrelerin öldürülmesi yöntemleri kullanılmaktadır. Genlerin alıcı hücreye aktarılması laboratuvar ortamında ya da doğrudan hastanın vücudunda gerçekleştirilebilmektedir. Hücre içine genin eklenmesinde viral (transdüksiyon olarak) ve viral olmayan (transfeksiyon olarak) iki genel yaklaşım bulunmaktadır. Viral vektörler viral olmayan vektörlere göre daha etkili bir gen tedavi yöntemidir. Gen tedavisi uygulamalarında birçok viral vektör sistemi geliştirilmiştir. Ancak, çoğu vektör transgenezin yararlılığını sınırlamaya neden olan bütünleşmeyi yapamamaktadır. En iyi karakterize edilmiş viral vektör, genomik DNA'ya entegre olabilme özelliğinden dolayı Retroviridae ailesidir. Fakat, onkoretroviral vektörler, bütünleşmeyi gerçekleştirebilmesi için hücre replikasyonu gereksinimi bulunmaktadır. Bu nedenden dolayı da sınırlı bir başarı göstermektedir. Lentiviral vektörler bölünmeyen hücrelerde de transdüksiyon yeteneğini sahip olduğu için onkoretroviral vektörler ile karşılaştırıldığında daha etkili bir transgen ifadesi oluşturabilmektedir. MERTK; LGALS3, TUB, TULP1 ve GAS6 gibi çeşitli ligandlara bağlanarak hücre dışı matristen gelen sinyalleri sitoplazmaya yönlendiren tirozin kinaz reseptörüdür ve MER/AXL/TYRO3 reseptör kinaz ailesinin bir üyesidir. Apoptotik hücrelerin hücre sağkalım, göç, farklılaşma ve fagositoz dâhil birçok fizyolojik sürecinde düzenleyici olarak görev almaktadır. MERTK geninde meydana gelen mutasyon sonucunda retina bozukluğu, kanser tipleri, melonama, çeşitli sklerotik lezyonlar meydana gelmektedir. Bu tezin amacı, çeşitli hastalıkların (retina bozukluğu, melonamo, çeşitli kanser türleri vb.) iyileştirilmesi için MERTK'yi lentiviral yöntemler kullanarak üretebilmek, çoğaltmak ve bir hücre hattına iletimini sağlayabilmektir. Bu tez çalışmasında; SH-SY5Y hücre hattından elde edilen MERTK geninin pLenti-CMV-GFP-2A-Puro vektörüne klonlanıp uygun paketleme plazmidleri ile birlikte 293T hücre hattına verilerek lentivirüs vektörü üretilmiş, inkübasyona bırakılarak çoğaltılmış ve hedeflenen hücreye iletimi başarıyla gerçekleştirilmiştir. Elde edilen MERTK geninin lentiviral vektör ile hücre hattına aktarılma metodunu ileride yapılmasını planlanan MERTK geni ile ilgili gen tedavisi çalışmalarında kullanılabilecektir.

Gene therapy is described as transfer of short oligonucleotides and genes, which are beneficial for curing genetics disorders that are responsible for development of illness. In gene therapy, many methods are utilized. These methods include adding gene to cure gene disorders, changing gene, repressing gene expression, killing special cells and insertion. Transfer of genes' to receiver cells occurs directly in human body or in laboratory. There are two methods in adding gene to intracellular. These are viral (transduction) and non- viral (transfection) methods. Viral method is more efficient than non- viral method in gene therapy.Many viral vector systems have been developed in implementation of gene therapy. However, unification that limits beneficial of transgenez couldn't be achieved by vast majority of these vector systems. Retroviridae family is most characterized viral vector due to its aspect of being able to integrate genomic DNA. But, onkoretroviral vectors need cell replication to make unification. It shows limited success because of that. Lentiviral vectors shows better transgen expression than onkoretroviral vectors due to its ability to show transduction in non- diving cells.MER/ AXL/ TYR03 is a member of receptor kinase family and MERTK is tyrosine kinase receptor, which directs signals coming from matrix of extracellular to cytoplasm by connecting many ligands (LGALS3, TUB, TULP1 AND GAS6). It takes duty for survival, migration, differentiation and phagocytosis of apoptotic cells as a regulatory. Mutation in MERTK gene results in retina disorders, cancer, melonama and various sclerotic lesions. The aim of the theisis is to produce, propagate and transmit MERTK to a cell line by using lentiviral methods for the treatment of various diseases (retinopathy, melonamo, various cancers, etc.). In this thesis study; The MERTK gene obtained from the SH-SY5Y cell line was cloned into the pLenti-CMV-GFP-2A-Puro vector and given to the 293T cell line together with appropriate packaging plasmids, the lentivirus vector was produced, amplified by incubation, and the targeted cell transduction was successfully performed. The method of transferring the obtained MERTK gene into the cell line with the lentiviral vector can be used in gene therapy studies related to the MERTK gene which is planned to be performed in the future.