Koşullu mutagenez tekniği ile transgenik axolotl geliştirilmesine yönelik vektörlerin tasarlanması ve in vivo incelenmesi

Abstract

Fiziksel travma, yaşlanma ve çeşitli hastalıklar, hücrelerde, dokularda ve hatta organlarda kalıcı hasarlara sebep olabilmekte ve insanların yaşam kalitesini düşürebilmektedir. Yaralı dokuları veya organları normal işlevlerini yeniden kazanacak şekilde eski haline getirmek, bu kısıtlamaları hafifletecek ve yaşam kalitesini arttıracaktır. Ne yazık ki, çoğu memeli dokusunun yenilenme potansiyeli sınırlıdır ve/veya yoktur. Ancak, semenderler kalp, omurilik, belirli beyin bölgeleri ve tüm uzuvları gibi karmaşık biyolojik yapıları hem yapı hem de işlev olarak yeniden oluşturabilmektedirler. Ayrıca, semenderler, tüm tetrapodların arasında en yüksek rejenerasyon yeteneğine sahip canlılardır. Bu nedenle, semender Ambystoma Mexicanum'da (aksolotl) yenilenmeyi sağlayan mekanizmaları incelemek, bu doğal süreç hakkında fikir edinmemize yardımcı olacaktır. Bu genleri rejenerasyon sırasında incelemek için doku ve/veya zamana özgü koşullu mutasyonların üretilmesi önem arz etmektedir. Zira mevcut metodolojiler, dokuya özgü fonksiyon kaybı mutantların üretilmesine izin vermemektedir. Bu tez çalışmasındaki temel amacımız, aksolotlda tek jenerasyon içerisinde koşullu mutasyonlar üretmemizi sağlayacak metodolojiler geliştirmektir. Bu amaç doğrultusunda gen hedefleme teknolojilerinden CRISPR/Cas9 aracılı doku spesifik ve zamansal kontrollü vektörler özel promotor-enhensır dizileri altında klonlanmıştır. Üretilen bu vektörlerin in vitro ve in vivo fonksiyonalitesi ve ekspresyon seviyeleri ileri mikroskopi teknikleri aracılığıyla görüntülenmiştir. Tasarlanan vektörlerin doku ve zamansal hedeflemesinin başarılı olması durumunda aksolotl rejenerasyon mekanizmalarında rol alan genler için kullanılabilecek bir sistem geliştirilmiş olacak ve bu sayede rejenerasyon temelli birçok hastalığın anlaşılması ve mevcut terapötik manipülasyonların geliştirmesine yardımcı olacaktır.

Physical trauma, aging, and some diseases can cause permanent damage from tissues to entire organs. Such situations decrease the quality of human life. Restoring injured tissues and organs to their normal function will alleviate these limitations. Unfortunately, most mammalian tissues lack functional regenerative capacity. While mammalian tissues have limited self-regeneration, salamanders can reconstruct complex biological structures like the heart, spinal cord, certain brain regions, and entire limbs in both structure and function. In addition, salamanders have the highest regeneration ability among all tetrapods such as axolotl. Unraveling the mechanisms underlying the regeneration process requires functional study of the genes involved. Studying these genes during regeneration often requires the creation of tissue and/or time-specific mutants. Current methodologies do not allow us to generate tissue-specific loss-of-function mutants, and therefore, new methods are needed. Our main goal is to develop a methodology that will enable us to generate conditional mutations in a single generation axolotl. For this purpose, one of the gene targeting technologies, CRISPR Cas9, and particular promotor-enhancers, were used to develop tissue specific and temporally controlled targeting. These unique promotor-enhencers were cloned into vectors before being tested in vitro and in vivo. Afterwards, expression results were demonstrated by advanced microscopy. If the vectors that allow tissue specific and temporal targeting in axolotls are successful, we can use this system to target genes that are involved in regeneration and study their specific functions in certain tissues and/or at a defined time during regeneration. A better understanding of the tissue specific function of certain genes should allow to understand and improve current therapeutic manipulations of many regeneration-based diseases.