Als2 silencing affects the expression of two NF-κB targeted genes via uxt in adult mouse primary spinal motor neuron culture

Abstract

Aim: Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder affecting motor neurons. Als2 is one of the genes that cause ALS, and its mutations leads to loss of function in alsin protein. The interaction between alsin, and UXT protein has been documented in vitro. UXT is a cofactor in NF? B pathway. Our aim is to investigate the potential effect of silencing of Als2 on the activity of NF-? B pathway in primary motor neurons. Method: Neurons were demonstrated immunocytochemically via reaction with anti-ChAT and anti-ßIII tubulin primary antibodies in spinal motor neuron culture of adult BalbC mice. Als2 was silenced using RNAi method and confirmed by qRT-PCR. Expressions of UXT, A20 and IL8 in motor neurons where Als2 was silenced were determined by qRT-PCR. TNF-? an NF-? B activator, was also applied and alterations in the expressions of A20 and IL8 were measured using qRT-PCR. Results: Expressions of Als2, UXT, and IL8 were reduced by 74.3%, 40%, and 84.4% by RNAi in immunocytochemically characterized spinal motor neurons (for all, p<0.0001). whereas A20 expression increased by 65% (p<0.0001). When TNF-? was applied to neurons, IL8 expression increased by 17-fold, but the increase in A20 was only 29.5%. Conclusion: In the light of these findings, correlation between expressions of Als2 and UXT has been proven. Decreases in the levels of Als2 and UXT cause a reduction in IL8 expression, whereas expression of A20 increases. This indicates that silencing of Als2 might reduce inflammatory response while activating pro-apoptotic signals. When NF-? B pathway has been activated by TNF-? a considerable increase in IL8 has been observed. Thus for the first time a functional link between Als2, and NF-? B pathway over UXT has been confirmed in primary spinal motor neuron culture, and the role played by key molecules as IL8, and A20 on NF-kB pathways has been demonstrated.

Amaç: Amiyotrofik Lateral Skleroz (ALS) motor nöronları etkileyen nörodejeneratif bir hastalıktır. Als2, ALS’ye neden olan genlerden biri olup, mutasyonları alsin proteininde işlev kaybına yol açar. Alsin ile UXT proteininin etkileştiği in vitro olarak gösterilmiştir. UXT NF-κB yolağında bir kofaktördür. Çalışmadaki amacımız, Als2 geninin susturulmasının NF-κB yolağı aktivitesine olan olası etkisinin primer spinal motor nöronlarda araştırılmasıdır. Yöntem: Yetişkin BalbC fare spinal motor nöron kültüründe, nöronlar anti-ChAT ve anti-βIII tubulin primer antikorları ile immünositokimyasal olarak gösterildi, Als2 geni RNAi yöntemi ile susturuldu ve qRTPCR ile doğrulandı. Als2’nin susturulduğu motor nöronlardaki UXT, A20 ve IL8 gen ekspresyonları qRT-PCR ile belirlendi. NF-κB aktivatörü olan TNF-α kullanılarak A20 ve IL8 ekspresyonlarındaki değişim qRTPCR ile ölçüldü. Bulgular: İmmünositokimyasal olarak gösterilen spinal motor nöronlarda RNAi ile Als2 gen ekspresyonu %74,3 oranında azaldığı (p<0,0001) ve UXT ekspresyonunun %40 düştüğü saptandı (p<0,0001). IL8 seviyesinin %84,4 azaldığı, ancak A20 seviyesinin %65 arttığı gözlendi (p<0,0001). Nöronlara TNF-α uygulandığında IL8 ekspresyonunun 17 kat yükseldiği, ancak A20 ekspresyonunun yalnızca %29,5 arttığı saptandı. Sonuç: Bu bulgular ışığında Als2 ile UXT arasındaki gen ekspresyonu seviyesindeki korelasyonun sağlaması yapılmıştır. Als2 ve UXT seviyesindeki düşüş IL8 seviyesini azaltırken A20’yi yükseltmektedir. Bu veriler Als2’nin susturulmasının enflamatuar yanıtı azaltırken pro-apoptotik sinyalleri A20 üzerinden tetikleyebileceğini düşündürmektedir. TNF-α kullanılarak NF-κB yolağı aktive edildiğinde, IL8 artışı üzerinden gerçekleşen enflamatuvar bir yanıt görülmektedir. Böylece Als2 ile NF-κB yolağı arasındaki işlevsel bağlantının UXT üzerinden gerçekleştiği ilk kez primer spinal motor nöron kültüründe doğrulanmış olup, IL8 ve A20 gibi NF-κB yolağındaki kilit moleküllerin bu bağlamda rol oynadığı gösterilmiştir.