Bioconjugated β-cyclodextrin-perfluorohexane nanocone clusters as functional agents for nanoparticle mediated histotripsy

Abstract

Nanocone clusters (NCC) as new generation agent of nanoparticle mediated histotripsy (NMH) successfully addressed all the limitations of previously designed nanodroplets (NDs). NCC can be obtained by simply mixing of FDA-approved cyclodextrins (CDs) and suitable perfluorocarbons (PFCs) resulted smaller size aggregates, detectable PFC amount and more stable for long term storage since obtained powder can be stored and redispersed when it is needed. Previous experimental and computational studies showed that NCC is an organization of inclusion complexes of CD and PFC around free PFC droplets and their aggregate behavior depend on the localization of PFC in the cavity and the water solubility of CD derivatives. It has been proved that beta-cyclodextrin (βCD) and perfluorohexane (PFH) are best candidates for NCC cluster that can be isolated as powder with high PFC content among various CDs and PFCs derivatives that are tested. This study focuses on further development of the selected best NCC composition to have advanced tools for in-vitro and in-vivo study. It is aimed to show the bioconjugation potential of NCC through the example of most commonly used functionalization such as targeting, PEGylation and fluorescent labeling. For this purpose, βCD as building block was monofunctionalized with the groups like azide, alkyne and amine that are capable for effective coupling reactions such as "click" reaction and EDC/NHS coupling. These monofunctional βCDs were used as building blocks of NCC in the presence of PFH to obtain functional NCCs as precursors of bioconjugation. EPPT1 as peptide based more specific and folic acid (FA) as most commonly used targeting agent along with PEGylation have been successfully showed as bioconjugation examples. Lastly, fluorescently labeled NCC was obtained via FITC and alkyne functional NCC reaction through propargyl amine and isothiocyanate group reaction. The obtained bioconjugates were tested in vitro to validate the conjugation and finally, their ability to lower cavitation threshold pressure on NMH were shown. All obtained bioconjugates not only successfully lowered the cavitation threshold pressure but also they were perfectly acting on desired bioconjugation tools to enhance the NMH study.

Yeni nesil nanoparçacık ortamlı histotripsi (NMH) ajanı olarak nanokap kümeleri (NCC), önceden tasarlanmış nanodamlacıkların (ND) sınırlamalarına cevap vermektedir. NCC, FDA onaylı siklodekstrinler (CD) ve uygun perflorokarbonların (PFC) karıştırılmasıyla elde edilebilen daha küçük boyutlu ve PFH miktarı saptanabilir kattılardır. NCC'ler depolanabildiklerinden ve gerektiğinde yeniden dağıtılabildiğinden saklama koşulları açısından daha kararlıdır. Yakın zamanda gerçekleştirilen deneysel ve hesaplamalı çalışmalar, NCC'nin, serbest PFC damlacıkları etrafındaki CD ve PFC konuk-konak komplekslerinin bir organizasyonu olduğunu ve bunların kümelenme davranışının, PFC'nin CD'nin iç kavitesindeki lokalizasyonuna ve CD türevlerinin suda çözünürlüğüne bağlı olduğunu göstermiştir. Beta-siklodekstrin (βCD) ve perfloroheksanın (PFH) etkileşiminden oluşan NCC'nin, test edilen çeşitli CD'ler ve PFC türevleri arasından yüksek PFC içeriğine sahip, toz olarak elde edilebilen en iyi NCC adayları olduğu kanıtlanmıştır. Bu çalışma, in vitro ve in vivo çalışmalarda kullanılabilecek, fonksiyonel ve yeni özelliklerin de yapıya dahil edilmesine olanak sağlayacak şekilde en iyi NCC kompozisyonunun fonksiyonlandırılmasına ve biyokonjugasyonuna odaklanmaktadır. Hedefleme, PEG'leme ve floresan etiketleme gibi en sık kullanılan biyokonjugasyon örnekleri üzerinden NCC'nin biyokonjugasyon potansiyelinin gösterilmesi amaçlanmaktadır. Bu amaçla, yapı bloğu olarak βCD, "click" reaksiyonu ve EDC/NHS çapraz bağlanması gibi etkin reaksiyonlar verebilen azit, alkin ve amin gibi gruplarla fonksiyonlandırılmıştır. Bu tek gruplu fonksiyonel βCD'ler PFH varlığında fonksiyonel NCC'ler elde etmek için yapı taşı olarak βCD ile birlikte kullanılmışlardır. Biyokonjugasyon örnekleri hedefleme ajanı olarak sıklıkla kullanılan folik asit (FA) ve daha spesifik hedefleme ajanı olarak peptit bazlı EPPT1 ile birlikte PEG'leme ve FITC ile floresans etiketleme seçilmiştir. Elde edilen biyokonjugatlar, hem yapısal olarak hem de etkinliklerini doğrulamak için in vitro test edilmiştir. Son olarak elde edilen bu NCC'ler kullanılarak gerçekleştirilen NMH kavitasyon eşik basıncı belirleme çalışmalarında tüm biyokonjugatların kavitasyon eşik basıncını başarılı bir şekilde düşürdükleri gösterilmiştir. Genel olarak bu çalışma elde edilen NCC'ler kullanılarak sadece NMH'deki kavitasyon eşik basıncının düşürülmesi değil aynı zamanda NMH çalışmasını geliştirmek için ihtiyaç duyulabilecek biyokonjugasyon araçlarının yapıya dahil edilebileceği ve etkin bir şekilde çalıştıkları ortaya koymuştur.